Białko zielonej fluorescencji, w skrócie GFP (Green Fluorescent Protein), to jedno z najważniejszych narzędzi współczesnej biologii, pierwotnie wyizolowane z meduzy żyjącej w północnej części Oceanu Spokojnego. Jego cechą charakterystyczną jest to, że w określonych warunkach emituje zielone światło, co naukowcy szybko nauczyli się wykorzystywać w badaniach komórki. Dołączając gen kodujący GFP do innych genów, które chcieli analizować, uwidaczniali niewidoczne dotąd białka, które mogli łatwo śledzić pod mikroskopem. Zrewolucjonizowało to biologię komórki, ponieważ umożliwiło prowadzenie obserwacji w żywych komórkach, w czasie rzeczywistym.

Jak wyjaśniła w rozmowie z PAP dr hab. Beata Wielgus-Kutrowska, prof. UW, z Instytutu Fizyki Doświadczalnej Uniwersytetu Warszawskiego, od lat badacze zakładali, że połączenie GFP z innymi białkami nie wpływa na właściwości tych drugich. - Przyjmujemy także, że gdy ten kompleks świeci, to białko GFP jest poprawnie złożone i zachowuje się naturalnie - wyjaśniła specjalistka. Najnowsze badania jej zespołu, opisane w „International Journal of Biological Macromolecules”, sugerują jednak, że nie jest to takie proste.

- Większość naukowców skupia się na tym, co GFP oświetla w komórce, a znacznie rzadziej zastanawia się nad tym, co dzieje się z samym GFP. My chcieliśmy sprawdzić, czy zawsze widzimy to, co powinniśmy zobaczyć. Czy np. sygnał nie jest zaburzony przez nieprawidłowe fałdowanie białka lub jego skłonność do łączenia się w większe skupiska, które mogłyby zakłócać odczyt - powiedziała.

Skąd bierze się zielone światło?

Jak ustalono w początkowych badaniach nad GFP, aby białko mogło emitować światło, musi najpierw odpowiednio zwinąć się w przestrzeni, tworząc charakterystyczną strukturę przypominającą beczułkę. W jej wnętrzu powstaje tzw. chromofor, czyli fragment cząsteczki odpowiedzialny za fluorescencję.

Powstanie chromoforu to jednak skomplikowany proces. Wymaga serii reakcji chemicznych, które zachodzą już wewnątrz gotowego (sfałdowanego) białka: najpierw fragment białkowego łańcucha zamyka się w pierścień, potem następuje reakcja z tlenem i dochodzi do utraty cząsteczki wody. Dopiero po tych zmianach białko zaczyna naprawdę świecić. Zatem nawet gdy cała struktura jest już uformowana, potrzeba czasu, by chromofor dojrzał i zaczął emitować promieniowanie. Oznacza to, że w pierwszych chwilach po powstaniu może być jeszcze nieaktywny, co uniemożliwia obserwowanie bardzo szybkich zjawisk w komórce.

Zespół badawczy przyjrzał się bliżej temu, jak GFP przyjmuje swoją aktywną (świecącą) formę. - Okazało się, w zależności od tego, czy obserwowany marker już wcześniej był sfałdowany i zdążył utworzyć chromofor, czy też białko zwija się po raz pierwszy (nie ma chromoforu), proces ten przebiega inaczej. Cząsteczka podlegająca pierwotnemu fałdowaniu ma większą skłonność do tworzenia nieprawidłowych form, które zlepiają się ze sobą, jednak proces ten jest mniej dynamiczny niż w przypadku białka z chromoforem. Natomiast cząsteczki, które uzyskały prawidłową strukturę, zaczynają świecić później w porównaniu z tymi, które zwijają się powtórnie - wytłumaczyła badaczka.

Jak podkreśliła, jest to jedna z przyczyn, dla których badania oparte na GFP wymagają ostrożnej interpretacji. - Brak świecenia nie zawsze jest jednoznaczny z brakiem markera i może maskować niektóre szybkie procesy zachodzące w żywych komórkach - zaznaczyła.

Kiedy białko nie składa się prawidłowo

W czasie analiz naukowcy zauważyli też, że sam proces fałdowania GFP nie zawsze przebiega prawidłowo. Czasem, zamiast przyjąć właściwy kształt, cząsteczki GFP zlepiają się ze sobą, tworząc większe skupiska - agregaty.

Takie agregaty nie świecą. Jeśli więc badacz nie widzi zielonego sygnału w danym miejscu komórki, może uznać, że białka tam nie ma. Tymczasem ono może być obecne, ale GFP jest w formie nieprawidłowo złożonej i niezdolnej do fluorescencji.

Z taką sytuacją można by się spotkać np. podczas badań nad chorobą Alzheimera. Naukowcy znakują za pomocą GFP specyficzne białka, które gromadzą się w mózgu pacjentów, tworząc charakterystyczne złogi. Jednak, może się zdarzyć, że choć złogi faktycznie się tworzą, to GFP również ulega agregacji i nie emituje światła. W efekcie złogi mogą pozostać niewidoczne pod mikroskopem, co utrudnia ich wykrycie i prawidłową ocenę.

Dodatkowym problemem jest to, że komórka może rozpoznawać agregaty GFP jako sytuację nieprawidłową i uruchamiać reakcje stresowe oraz systemy usuwania uszkodzonych białek. W efekcie badacz obserwuje nie naturalny proces biologiczny, ale odpowiedź komórki na kłopotliwe białko znacznikowe.

Molekularna żarówka

GFP ma przede wszystkim jedno zadanie - świecić, by uwidocznić inne białko w komórce, co pozwala śledzić pod mikroskopem lokalizację i ruch tego drugiego. Okazuje się jednak, że - wbrew dotychczasowej wiedzy - sama obecność lub nieprawidłowa struktura tego znacznika może wpływać na zachowanie śledzonego białka.

Badania prof. Wielgus-Kutrowskiej wykazały, że zarówno podczas fałdowania pierwotnego, jak i wtórnego, cząsteczki GFP w różnym tempie przyjmują formy przejściowe, które mają niejednakową skłonność do tworzenia agregatów. Ponadto zielona fluorescencja pojawia się w różnych odstępach czasu. Może to wpływać na błędną interpretację wyników i fałszywe wnioski o zachowaniu molekuł, których markerem jest GFP.

Nie tylko zielone

Dziś poza GFP naukowcy dysponują całą paletą białek fluorescencyjnych w różnych kolorach. Choć różnią się barwą, mają podobną budowę przestrzenną. Oznacza to, że problem może nie dotyczyć wyłącznie klasycznego, zielonego znacznika.

Ekspertka z UW podkreśliła, że wnioski uzyskane przez jej zespół są ostrzeżeniem: fluorescencyjne białka markerowe to niezwykle użyteczne narzędzia, ale nie powinny być traktowane jako bezwzględny dowód, że wszystko w komórce przebiega tak, jak zakłada badacz. Czasem zielone światło lub jego brak może maskować problemy, których nie widać na pierwszy rzut oka.

Katarzyna Czechowicz

kap/ zan/